EdU细胞增殖检测

EdU细胞増殖检测试剂盒(红色荧光)使用说明

 

产品简介

       细胞增殖是评价细胞活性、代谢、生理和病理状况的重要指标。EdU (5-Ethynyl-2,- deoxyuridine)是一种胸腺嘧啶核苷类似物，其连有的炔烃基团在天然化合物中很少见，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)掺入正在复制的DNA分子中，通过基于EdU与荧光染料的特异性共轭反应，把荧光集团标记到新合成的含有EdU的DNA上面，这样就可以进行高效快速的检测出DNA复制活性，广泛应用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA损伤修复等方面的研究。
       传统的免疫荧光染色(BrdU)检测方法需要DNA变性、抗原修复、抗原抗体过夜孵育等复杂繁琐的操作步骤。而EdU检测方法不需要剧烈的DNA变性，只需温和的细胞固定化和透化处理，能够较好地保护细胞形态、DNA整体结构及细胞内抗原识别位点，操作步骤更加快速、灵敏和准确。EdU与胸腺嘧啶(T )结构非常相似，而EdU染料大小只有BrdU抗体的1/500,在细胞内很容易扩散，无需DNA变性(酸解、热解、酶解等)，可有效避免样品损伤，而且无需抗原抗体反应，能在细胞和组织水平更快速便捷地反映DNA复制活性。

试剂盒组分


产品编号

试剂

浓度

试剂量

保存条件

 
 
 
C1501/1502/1503
 
 

EdU溶液

1000X

40ul

室温运输，4℃长期储存，勿冻存，荧光试剂请避光保存。

反应缓冲液

10X

1 ml

催化剂溶液

25x

400ul

TAMRA 红 色荧光溶液

400x

25ul

缓冲添加剂

粉末

200 mg

Hoechst 33342

1000X

20ul

 


使用前须知
       该产品是采用成像检测方法对贴壁细胞进行检测，适用于荧光显微镜、共聚焦显微镜等仪器。非贴壁细胞可在孵育EdU后进行细胞涂片处理，固定后再采用贴壁细胞的染色流程进行检测。也可以应用于流式细胞仪检测。

实验步骤(以24孔板，HK2贴壁细胞为例)

EdU标记
(a)      将细胞完全培养基中按照500: 1的 比例加入EdU溶液，制成2xEdU标记培养基；
(b)      提前将2xEdU标记培养基预热，然后等体积加入到细胞原有培养基中，获得lxEdU溶液，其中EdU的终浓度为10 uM；
注：    1)我们不建议替换全部培养基，因为这样可能会影响细胞增殖的速度；
           2)配置好的培养基建议现用现配，用量以没过细胞为宜；
(c)      每孔加入300ul含EdU培养基孵育细胞2小时，弃培养基；
注：   1)培养时间取决于细胞的增殖速度和生长状态；
          2)大多数**细胞以及粘附细胞系均可采用2小时的孵育时间
(d)     以lxPBS清洗细胞两次，毎次5分钟，以除去未掺入DNA的EdU残留。
注：  贴壁不牢的细胞可降低清洗强度。

细胞的固定和通透
(a)     每孔加入150ul 4%多聚甲醛细胞固定液，室温培养30分钟，弃固定液；
(b )    毎孔加入150ul 2mg/ml甘氨酸，摇床孵育5分钟，以中和过量的多聚甲醛；
(c )    弃甘氨酸溶液，每孔加入300 ul PBS 洗液，室温清洗5分钟；

(d)     每孔加入300ul 0.5% Triton X-100细胞通透液，室温通透10分钟，弃细胞通透溶液；
(e )    每孔加入300ul PBS洗液，室温清洗5分钟；

EdU染色
(a)     通过用10: 1去离子水稀释10x反应缓冲液进行配制1xEdU反应缓冲液；
(b)     按照溶解200mg缓冲添加剂溶于1ml去离子水的比例称取适量的粉末进行溶解， 即为可用的缓冲添加剂的浓度，建议现用现配；
注：  缓冲添加剂为白色粉末，较难准确称量，称量范围可稍微放宽，但是不应超过±20%，且该粉末较易氧化，使用后请旋紧管盖，如试剂出现棕黄色，则需报废或更换。
(c)     按照以下的表格进行染色反应液的配制：

染色反应液组分

500ul

1 ml

2 ml

5 ml

IX反应缓冲液

430ul

860ul

1.8 ml

4.3 ml

催化剂溶液

20 ul

40 ul

80 ul

200 ul

TAMRA红色荧光溶液

1.2 ul

2.5 ul

5 ul

12.5 ul

缓冲添加剂

50 ul

100 ul

200 ul

500 ul


(d)     每孔加入100ul配置好的检测混合液，以覆盖细胞为宜，避光、室温孵育30分钟。
(e)     弃染色反应液，加入300 ul  0.5% TritonX-100细胞渗透液清洗2-3次，每次10 分钟；
(f)      弃细胞渗透液，用PBS洗两次，每次5分钟。


DNA染色

(a )    将Hoechst 33342用PBS 溶液1: 1000 进行稀释得到终浓度为5ug/ml的 lx Hoechst染色液；
(b )    每孔加入300ul 1x Hoechst染色液，室温避光孵育20-30分钟后，弃染色液；
(c )    每孔加入300ul PBS洗细胞两次，去掉洗液。