1、 取新鲜抗凝全血（EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝血均可）或者去纤维蛋白血液，用等体积的全血及组织稀释液或者PBS稀释全血。

2、 取一支无菌离心管，先加入试剂A，再加入试剂D，使两者形成梯度界面（试剂A：试剂D的体积比为3：2，如稀释后的血液样本小于5ml，则先后加入3ml试剂A和2ml试剂D；如稀释后的血液样本大于5ml，试剂总量与稀释后的血液样本量相等），两种试剂的分层一定要清晰。

3、 将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。如果样品较多，加样的时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象）

4、 室温，水平转子500~800g，离心20~30min（血液的体积越大所需的离心力越大，离心时间越长，最佳的分离条件需自行摸索，离心转速最大不超过1000g）。

5、 离心后将出现明显的分层： 第一层为血浆层；第二层为白色单核细胞层；第三层为透明试剂D液层；第四层为半透明试剂A液层；第五层为红细胞层（如图示）。

6、 小心吸取第二层白色单核细胞层到另一无菌的15ml离心管中，加入10mL细胞洗涤液或PBS，颠倒混匀，250g，离心10min。

7、 弃上清，5mL的细胞清洗液或PBS重悬细胞，250g，离心10min。

8、 重复步骤7

9、 弃上清，细胞重悬备用。

10、 差异贴壁法纯化细胞：用单核细胞培养基以106个/ml的密度重悬细胞，将细胞铺于细胞板或细胞瓶中，置于细胞培养箱中进行贴壁培养。

1) 2~4 h内贴壁的为单核细胞。

2) 10~24 h内贴壁的单个核细胞为内皮、内皮祖细胞、干细胞 。

3) 不贴壁的为淋巴细胞。