1、吸去旧培养液。

2、PBS冲洗3次，每次2ml。

3、吸去PBS，胰酶1.5ml，放入孵育箱，消化4min后取出观察细胞悬浮情况。

4、3ml培液中止消化，轻轻吹打至底壁透光，制成细胞悬液。

5、吸入15ml离心管中，1000r/5min离心。

6、吸去上清，加入1ml冻存液（冻存液配制方法：DMSO和血清按1:9配制成10ml,离心管外面裹一层铝箔避光，放入4度冰箱保存），吹打均匀，吸入冻存管中。

7、放入梯度降温盒，-80℃冰箱过夜。

8、24h后从梯度盒取出冻存管，放入液氮罐保存（长期保存需放入液氮罐，短期3个月内冻存放入-80摄氏度即可）。