实验原理

慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。

慢病毒包装质粒可提供转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的辅助蛋白。

1. 外壳糖蛋白 识别并感染宿主细胞
2. 结构蛋白 病毒复制所需要的酶

试验流程

1.细胞准备

HEK-293T细胞提前一天铺板，每10cm细胞培养皿接种3~5×106cells，置于37℃，5% CO2 培养箱培养18h～24h后，转染前细胞密度80%左右。

注意：细胞消化要充分，成团生长的细胞会影响转染效率。细胞状态对于病毒包装至关重要，保证细胞良好状态（实验成功的关键因素），无支原体污染。

2. 质粒转染（4-5天）

将包装质粒和 GFP Control Plasmid（或阴性对照质粒或目的基因慢病毒载体质粒）共转染入 293T 包装细胞中。

以下操作均以 10cm dish，转染试剂采用simple fect为例，其他转染试剂和转染时质粒用量需根据培养器皿的规格进行适当调整。

（1）转染前1~2h 将需要转染的细胞更换新鲜的培养基（DMEM+5% FBS），8mL/10cm皿。

（2）按下表配制转染体系，吹打混匀。（三质粒比例4:3:1）

（3）按照DNA：simple fect=1:2.5的比例将转染试剂(12+9+3)×2.5=60ul，加入并吹打混匀，室温静置20min形成转染复合物。

（4）取转染复合物，逐滴添加到培养皿中，呈“十”或“8”字形轻轻摇晃混匀。

（5）转染6-8h后更换7 ml不含双抗的新鲜培养基（DMEM+10% FBS）。（此时弃去的培养基中已含有少量的病毒，废液以及所用的移液枪头必须经处理后才能丢弃）

（6）换液后48h，用移液枪从培养皿的一侧收集上清液到15mL离心管，3000 r/min离心5 min并用0.45mm滤膜过滤去除死细胞，过滤后的细胞上清液如果暂时不进行进一步处理，可分装后置于-80℃冰箱保存。

注意：通常细胞转染24h后就可以看到荧光蛋白的表达，293T 细胞会明显的皱缩成圆形，48h可以进行荧光照片的采集，判断转染效率。

一般为了能获得高滴度的病毒，需要通过不断优化条件，提高转染效率。优化条件包括：细胞培养条件，转染试剂的优化，三质粒比例的优化（1:1:1）等

3.慢病毒的浓缩与纯化（提高病毒滴度和纯度）

采用PEG8000方法浓缩病毒

（1）5× PEG8000 -NaCl配制：称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50 g溶解在200 mL纯水中；121 ℃ 30 min 湿热灭菌 ；保存在4℃；

（2）每30ml过滤后的粗病毒液，加入5× PEG8000 -NaCl母液7.5 mL；

（3）每20～30min混合一次，共进行3-5次，4℃放置过夜；

（4）4℃，4000 g，离心 20min；（离心后可以直接看到病毒沉淀）

（5）吸弃上清，静置管子1～2min，吸走残余液体；（吸走液体时要小心，不要吸走了沉淀）

（6）加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；（PBS溶液或培养基）

（7）溶解后的病毒悬液分装成小份，保存于-80 ℃，避免反复冻融。（冻融一次，滴度下降10%左右）

4.滴度测定

荧光计数法，耗时5天。

（1）测定前一天，将HEK-293T细胞铺板，96 孔板，每孔加 5×104个细胞，体积为 100μL；

（2）在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准备10个1.5ml EP管，每管加入900μl培养液，往第一个管中加入100μl病毒原液，混匀后，吸取100μl加入第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度，每个稀释度可做3个重复孔；

（3）选取所需的细胞孔，吸去培养基。加入 100μl 稀释好的病毒溶液。放入培养箱培养24h；

（4）弃去带病毒的培养液，每孔加不含双抗的完全培养基；

（5）48h后观察荧光，应有初步表达；72h后观察荧光，计算滴度。

滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量。比如在加入 10-6 μl 病毒原液的孔中观察到2 个带有荧光的细胞，就是 2/（10-6）=2E+6，单位为 TU/μl，也就等于 2E+9 TU/ml

5.感染目的细胞 （耗时3-4天）

（1）细胞铺板 将状态良好的目的细胞接种到6 孔板，接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于 50%至 70%；

（2）病毒感染 更换不含双抗的新鲜培养基2mL，从冰箱取出并在 37℃水浴中快速融化病毒并根据最佳MOI计算所需病毒液体积加入六孔板中（一般实验操作采用粗病毒液半体积感染），每孔加入终浓度为8µg/ml polybrene；

（3）24h后更换不含双抗的新鲜培养基2mL；

（4）48h后观察荧光。（代谢比较缓慢的细胞GFP表达所需时间较长，72h可以观察到荧光）

注意：感染后期请根据细胞生长的情况对细胞进行及时换液和传代，以保证细胞良好的生长状态

①Polybrene（聚凝胺）:是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入 polybrene 能提高感染效率 2～10 倍。

Polybrene 有一定的细胞毒性，有的细胞对 polybrene 的毒理反应明显，因此细胞感染时是否适合 polybrene 需要摸索；不同细胞对 polybrene 的敏感度不同，可以用 1～10μg/ml 的范围筛选合适的浓度，以 24h 内细胞无明显毒性反应为佳，可参考文献并进行预实验摸索，polybrene 最常用的工作浓度为 6～8μg/ml。

②感染细胞最佳 MOI 的确定

MOI（multiplicity of infectin）感染复数，含义为每个细胞被多少个有活力病毒所感染。在实验中将某个细胞达到 80%感染时所需的 MOI 值定义为这个细胞的 MOI 值。相关文献支持或感染预实验 需要的病毒体积=（MOI×细胞数）/病毒滴度

6.加压筛选（7天左右）

根据包装的慢病毒载体上的筛选抗生素，进行加压筛选，这里以嘌呤霉素为例

（1）每 2-3 天换含 puromycin 的完全培养液一次，至不感染筛选对照组细胞被 puromycin

杀光。 western blot 或者 qPCR 检测目的蛋白的表达效率。

（2）可进行以下两步操作（依照具体实验需要选择）

①不挑取单克隆：将感染并筛选后的细胞进行传代，并继续施加低浓度 puromycin 进行维持性筛选培养。连续筛选并传 3 代后，冻存稳定细胞株。

②挑取单克隆：制备细胞悬液，用培养基稀释细胞到1个/10µl，接种到96孔板中，会有一部分孔中只有单个细胞，对其扩大培养，western blot 或者 QPCR 检测目的蛋白的表达效率。

注意：

①不同细胞对嘌呤霉素的敏感程度也不一样，所以需要设浓度梯度进行预实验。经验是从1µg/ml到10µg/ml或者参考文献去设立3-5个浓度梯度；

②再培养24-48h后观察细胞的死亡情况，选择最佳的嘌呤霉素浓度孔细胞进行后续实验；

③嘌呤霉素最佳浓度的确定：首先是未感染的正常细胞必须全部死亡，其次就是根据各孔细胞死亡情况来确定，一般选择死亡超过50%，细胞生长速度较其它孔不会明显降低。因为细胞死亡少的话可能会有很多低表达量的细胞存在，如果细胞死亡过多，也会导致细胞扩增很慢，不利于快速获得稳定细胞株；

④选择了最佳的嘌呤霉素浓度，不代表后面一直用这个浓度，要根据细胞的生长情况来判断，适当的去增减嘌呤霉素的浓度。