一、实验材料

1，RNA待测样本（注：本人用的是直接提取的RNA，为了实验更严谨，应当先进行mRNA纯化）

2，无酶水

3，TBST（1×TBS， 0.1%Tween-20）

4，封闭液

5，一抗

6，二抗

7，ECL显影液

8，亚甲蓝染色缓冲液（0.4M醋酸钠、0.4M醋酸中的0.2%亚甲蓝）

二，实验设备

无酶EP管

加热设备

NC膜 或 带正电荷的尼龙膜（建议使用尼龙膜，专门用来做核酸交联，效果比NC膜好）

干净的塑料盒或者培养皿

烘箱或者带有254nm灯泡的交联设备（可用紫外线消毒灯代替，1m范围内有效）

显影设备

三，流程

1，取出待测RNA样本，解冻后测量RNA浓度，全程冰上操作。

2，将样品浓度统一，并在新的无酶管连续稀释样品并混匀，稀释梯度不固定，可自己试试最好效果。我选择的终浓度为400/200/100 ng/μL 。

3，离心后，将RNA样品95℃加热3分钟以破坏二级结构，结束后立即冰上冷却，防止重新形成二级结构。

4，用1ml枪头粗端在NC膜上留下圆形印记，以引导加样，随后将NC膜裁剪成合适的尺寸，转移至干净的塑料盒中。

5，将2μl RNA样品按顺序滴在NC膜上，注意枪头不要碰膜，样品应在膜上自然扩散，每次加样都需要更换枪头。

6，室温下NC膜上稍干燥后可进行RNA与膜的交联。方法一：37℃烘箱 30min。方法二：254nm波长的紫外线灯下照射30min-1h。

7，10ml TBST清洗膜5min，洗去未结合的RNA。

8，弃去TBST，加入10ml封闭液，室温摇动孵育1小时。

9，弃去封闭液，加入含有一抗的封闭液4℃孵育过夜。

10,10ml TBST清洗膜3次，每次10min。

11，二抗室温孵育1小时。

12，同第10步。

13，ECL底物孵育5min

14，显影仪下拍照

15，拍完照后，将膜放置于10ml亚甲蓝染色缓冲液中，室温摇动孵育30min

16，用ddH2O清洗至背景大致干净即可，约30-60s

17，白光成像采集亚甲蓝染色后的图像作为负载对照。